ペプチド核酸の開発

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12482 (2023) この記事を引用

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食品の安全性を確保するために、食品由来の病原体を検出するための多数の新しい方法が広範囲に開発されてきました。 重要な食中毒菌の中でも、セレウス菌がさまざまな食中毒を引き起こす懸念される病原体として特定され、この病原体の効果的な検出法の開発に関心が集まっています。 培養と生化学的確認検査に基づく標準的な方法も利用可能ですが、時間と労力がかかります。 代替の PCR ベースの方法が開発されていますが、ハイスループット能力と使いやすさに欠けています。 したがって、この研究では、特異性の高いピロリジニル ペプチド核酸 (PNA) を、多重化およびハイスループット能力を備えたビーズ アレイ法のプローブとして活用することにより、B. セレウス検出のための堅牢な方法を開発することを試みます。 この研究では、groEL、motB、および 16S rRNA 配列を持つプロリル-2-アミノシクロペンタンカルボン酸 (ACPC) バックボーンを持つ PNA を 3 セットの蛍光バーコード付きビーズと共有結合させて、3 つの B. セレウス遺伝子を検出しました。 開発された acpcPNA ベースのビーズ アレイは、B. cereus の存在下でシグナルのみが検出可能であり、他の種ではシグナルが検出されないという良好な選択性を示しました。 ゲノム DNA の検出におけるこの acpcPNA ベースのビーズ アッセイの感度は、groEL、motB、および 16S rRNA に対してそれぞれ 0.038、0.183、および 0.179 ng であることが判明しました。 この性能は、対応する DNA よりも明らかに優れており、したがって、DNA よりも acpcPNA の結合強度がはるかに強いことが確認されました。 開発された方法の堅牢性は、食品指標からの干渉を最小限に抑えながら、人工的に添加した牛乳とからし菜のピクルスをテストすることによってさらに実証されました。 したがって、この概念実証の acpcPNA ベースのビーズ アレイ メソッドは、食品由来の病原体に対する有効な代替核酸ベースのメソッドとして機能することが証明されています。

セレウス菌は、インスタント食品、発酵食品、乳製品に至るまで、幅広い食品に含まれる主要な食中毒病原体の 1 つです1。 B. セレウスは、極端な pH と温度に対する耐性により、食品加工のさまざまな段階でよく見られ 2、その結果、世界中で深刻な食中毒が発生し、全体の蔓延率は 23.746% にも達しました。 ヨーロッパでは、黄色ブドウ球菌に次ぐ食中毒発生の 2 番目の原因となっています3。 米国では、年間約 63,000 人が病気になり、入院率は 0.4% でした。

食品中のセレウス菌のタイムリーな監視と検出を可能にする迅速かつ正確な方法は、その発生を減らすための重要な緩和方法として役立ちます。 さらに、すべてのバチルス種が病原性を持っているわけではないことを考えると、バチルス種のレベルまで識別できることが不可欠です5。 ISO 7932:2004 の標準メソッドは寒天プレートベースの計数プロトコル 6 に基づいて利用できますが、このメソッドは時間と労力がかかります (30 °C で最大 24 時間のインキュベーション期間が必要で、確認にはさらに 2 ～ 7 日かかります)アッセイ）、訓練を受けた専門家が必要です。 B. セレウスを同定するために、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) ベースの技術などの代替分子法が開発されています 7,8。 ただし、これらの PCR ベースの方法のほとんどは、PCR 産物を視覚化するために低解像度のゲル電気泳動法に依存しているため、結果の解釈が困難です。 したがって、これらの制限を克服するために、定量的 PCR (qPCR) やマルチプレックス PCR などの多くの高度な PCR ベースの技術が開発されてきました 9,10,11 が、プライマーダイマー形成による複雑さのため、そのマルチプレックス能力は依然として制限されています 12。 さらに、ほとんどの PCR ベースのメソッドは、温度、pH、酵素などの環境要因によって分解される可能性がある特異的プローブとして DNA に依存しています。

これらの制限を克服するために、この研究では、多重化能力の利点とビーズアレイ技術からの結果取得の容易さ、および代替プローブとしての高特異性ペプチド核酸（PNA）の利点を組み合わせたB.セレウスの検出方法を紹介します。 この研究で使用されるビーズ アレイ プラットフォームは、さまざまな種類のターゲットに対応する高スループット、高感度、多重 xMAP テクノロジーに基づいています 13,14。 この方法では、求核性リガンドの共有結合のためにカルボキシル基で官能化された常磁性蛍光バーコードビーズを利用します。 各ビーズセットは赤色レーザーによって識別でき、緑色レーザーによって蛍光レポーター（R-フィコエリトリン）からのシグナルが測定されます13、15、16。 従来の DNA マイクロアレイ技術と比較して、ビーズ アレイ技術にはいくつかの利点があります。 まず、この手法のスループットは明らかに優れています。 これは、DNA マイクロアレイ技術が半自動であると考えられているが、半自動ではないためです。 第二に、ビーズアレイ技術は自動洗浄ステップにより、通常、DNA マイクロアレイ技術よりもバックグラウンドが低く、一貫性が高くなります 17。 最後に、ビーズ アレイ技術の検出器のコストは DNA マイクロアレイの検出器のコストよりもはるかに安いため、より実用的になります。 このように、さまざまな DNA ベースのビーズ アレイ システムは、食物アレルゲン 18、鶏肉に含まれる食中毒菌 19、ネズミチフス菌、ブルセラ菌、セレウス菌、シゲラを含む 4 種類の食中毒菌など、さまざまな食品汚染の検出に成功しています。種乳製品20. 興味深いことに、報告された B. セレウス検出方法では、検出可能なシグナルを得るために 38 °C の高温が必要でしたが、これはおそらく PNA-DNA 結合と比較して DNA-DNA 結合の安定性が低いためと考えられます。 このため、実際の工業的処理には実用的ではありません20。 さらに、これらの報告されたビーズアレイ法はすべて、特異的プローブとして DNA を利用しており、その特異性はハイブリダイゼーション温度とプローブの長さに大きく依存します 21。 DNA 標的に対する結合親和性がより優れた代替の核酸模倣物を使用すると、全体的なセンシング性能が向上するのではないかと考えられます。